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Micobotánica-Jaén
La primera revista digital de Micología y Botánica en castellano. ISSN 1886-8541
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AÑO VII Nº 2 / ABRIL - JUNIO 2012
MICOLOGÍA MICROSCÓPICA
por M. Martínez Quesada

Avda. Granada, 57. 23003 Jaén ESPAÑA

Micobotánica-Jaén AÑO VII Nº 2 (2012) ISSN 1886-8541
 
Resumen. MARTÍNEZ QUESADA, M. (2012). Micología microscópica.

Se realiza un estudio comparativo de los procedimientos de la macro y micro micología para que, mediante la divulgación de las similitudes de las técnicas utilizadas en ambos campos, pueda incrementarse el interés por el estudio de los hongos microscópicos.
Palabras clave: micología, microscopía, hongos.

Summary. MARTÍNEZ QUESADA, M. (2012). Microscopic mycology.

We carried out a comparative study of the procedures of the macro and micro mycology to, through the disclosure of the similarities of the techniques used in both fields, increase interest in the study of microscopic fungi.
Key words: mycology, microscopy, fungi.

INTRODUCCIÓN 1

La afición a la micología no puede realizarse con profundidad si no se dispone de un microscopio debido a la necesidad del estudio de las esporas para decidir la clasificación exacta de especies macroscópicas.
Por tanto con el término "micología microscópica" queremos referirnos a la dedicación al estudio de géneros del Reino Fungi que inevitablemente tienen que ser estudiados en todas las operaciones mediante el microscopio, bien por ser unicelulares o porque siendo pluricelulares, son imposibles de distinguir a simple vista.

En la mayoría de las ocasiones, la afición a los hongos se produce después de la afición a las setas.
El espíritu científico hace que tras interesarnos por algo, nos preguntemos su filogenia, su estructura su composición y sus propiedades.

Para ser precisos en el lenguaje, en tanto que nos vamos a referir en este escrito a hongos microscópicos y macroscópicos, debemos hacer la advertencia de que la mayoría de las veces en que hagamos mención a los hongos macroscópicos, nos estaremos refiriendo a su aparato reproductor sexual o setas.

Curiosamente son pocos los aficionados a las setas que se interesan por el hongo que las origina. Las razones pueden ser muchas, variadas y desde luego totalmente justificables. Seguramente una de las más importantes será que el hongo es difícilmente visible y poco atractivo, al contrario de lo que le ocurre a las setas.
No ocurre lo mismo entre los aficionados a la botánica, ya que la planta suele tener mayor porte y vistosidad que el fruto. Normalmente cuando los botánicos clasifican una planta, se suelen apoyar mayormente en los caracteres de la planta y en una pequeña medida en los del fruto.

INTRODUCCIÓN 2

Es un hecho común que en las Sociedades Micológicas, el número de los asociados que se especializan en los hongos macroscópicos es muy superior al de aquellos que preferimos el estudio de los microscópicos.
Es posible que el aspecto gastronómico que impregna la afición a la micología, produzca este sesgo acentuado, en la distribución entre los aficionados.

Sería injusto afirmar que todos los aficionados que salen al campo a recolectar setas, lo hacen solamente por el placer de comerlas después. La prueba de que no siempre es así la podemos encontrar en las exposiciones que se realizan con cierta periodicidad por parte de las asociaciones y también en las publicaciones de los magníficos trabajos científicos sobre hongos no comestibles.
Pero sí es un hecho indudable que la mayor parte de los aficionados salen al campo los fines de semana pensando en los placeres gastronómicos que les depararán sus capturas.
Nada hay que objetar a este respecto porque siendo una afición sana, el interés científico o gastronómico es igualmente respetable.

Sí que ocurre que la frase que más se pronuncia en las alegres excursiones micológicas sea "¿Esta se come?". Como si solo mereciera la pena coger setas para engullirlas.
Es probable y lo digo como hipótesis, que este desmesurado sesgo hacia los "setívoros", produzca una enorme escasez entre los aficionados a lo microscópico.
Sin embargo los hongos microscópicos, unicelulares o pluricelulares, son tan interesantes desde el punto de vista científico o gastronómico como los macroscópicos.

Imaginemos un mundo sin pan, vino, cerveza, quesos, chacinas, encurtidos, aguardientes, licores, vinagres, mantequillas, antibióticos, salsa de soja, choucroute...
Todos estos productos no podrían producirse sin la colaboración de los hongos microscópicos.

DE LAS OPERACIONES EN MICOLOGÍA MACROSCÓPICA

El proceso normal de actuación en la micología macroscópica puede ser resumido como:

Elección del punto de búsqueda
 
Excursión recolectora
   
Conservación de los ejemplares
     
Clasificación

Una vez realizada la clasificación, según que los objetivos sean la divulgación científica, la industria o la gastronomía, los siguientes procesos se diversifican.

Si el objetivo es científico los siguientes procesos suelen ser:

Trabajos de laboratorio
 
Redacción de un informe
   
Publicación en revista especializada

Si el objetivo es industrial:

Ensayos de reproducción controlada
 
Selección y mejora
   
Adecuación sustrato, hongo
     
Inducción del crecimiento
       
Obtención del producto final

Si el objetivo es gastronómico:

Limpieza y conservación
 
Elección y ensayo de la receta adecuada
   
Degustación

Como la mayor parte de los aficionados son a lo macroscópico, los procesos anteriores no precisan aclaración.

DE LAS OPERACIONES EN MICOLOGÍA MICROSCÓPICA

El apartado anterior podría ser copiado en su integridad para describir estos procesos. Pero como nuestra intención es contribuir a divulgar esta rama de la micología, haciendo proselitismo de nuestra afición, no solo para no sentirnos solos en nuestras excursiones, sino para disponer de compañeros con los cuales intercambiar conocimientos y experiencias, vamos a ampliar el comentario en cada uno de los procesos ya enumerados.

Advertimos que el mundo de la micología microscópica es lo suficientemente grande como para que el aficionado necesite una especialización en géneros e incluso en especies y variedades.

Se puede afirmar que los hongos tal como se han estudiado clásicamente, son un grupo polifilético. Es decir, que hemos agrupado mediante homoplasias grupos que filogenéticamente pertenecen a varios clados, lo cual quiere decir que no tienen un antepasado común cercano.
Estamos considerando hongos a grupos que pertenecen al Reino Protozoa (Mixomycota) y al Reino Chromista o Stramenopila (Labyrinthulomycota).
Es algo que también se ha hecho con las algas.

Estrictamente ningún taxon debe ser polifilético.
Los hongos sensu stricto son los pertenecientes al Reino Fungi.

En este trabajo queremos hacer referencia a las "levaduras". Pero la primera pregunta que surge es ¿qué son las levaduras?
No son un taxon, sino una agrupación artificial y como tal hay muchas opiniones de los individuos que deberían o no pertenecer a este grupo.
Para trabajar con un grupo es necesario disponer de bibliografía auxiliar por tanto para poder utilizar el tratado The yeast de J. Lodder y N.J.W. Kreger Van Rij, vamos a considerar levaduras a los individuos pertenecientes a tres familias:

Endomycetaceae
Sporobolomycetaceae
Cryptococcaceae

La clasificación que hemos utilizado se presta a tantas objeciones como otras que habríamos podido utilizar, pero al menos nos sitúan en el área científica en que estamos trabajando.

Elección del punto de búsqueda

A escala industrial, la búsqueda de nuevas variedades se suele realizar bien en los bancos de levaduras internacionales.
Es frecuente también que se utilicen los propios cultivos para buscar variedades que suelen aparecer al azar por mutación espontánea o por cruce.
Pero un aficionado normalmente buscará nuevas variedades en el epicarpio de frutas salvajes maduras, en hojas caídas o también en la flora superficial de alimentos en los cuales sospecha la presencia de la variedad buscada.

Excursión recolectora

La planificación de la recolección se puede realizar en compañía de aficionados a las setas, cualquiera que sean los objetivos de éstos.
Esto es interesante por varias razones: La relativa soledad de los aficionados a los microscópicos, la relativa coincidencia entre los lugares idóneos de recolección y finalmente la posibilidad de simultanear ambas actividades.

Conservación de los ejemplares

La conservación de las muestras durante la excursión se suele realizar en pequeños tubos de ensayo estériles con tapón de rosca numerados. En un cuaderno de campo tenemos que identificar el número de la muestra con la descripción exacta de las circunstancias de la toma de la muestra:

- Fecha: Ya que la flora microbiana cambia durante el año.

- Zona exacta: A poder ser mediante coordenadas UTM (es aconsejable un GPS portátil con un mapa topográfico).

- Sustrato recolectado: La descripción exacta de la muestra tomada identificando si es posible el género y especie de la planta muestreada. Esto es importante debido a que durante el traslado cambiará el aspecto de la muestra.

Clasificación

Una vez llegadas las muestras al laboratorio hay que tener en cuenta que en cada una de ellas existirán una gran cantidad de especies de levaduras, bacterias y mohos.

1. La primera operación es la de traspasar las células a medio acuoso. Para ello se sumerge la muestra en un mosto estéril de uva o malta que son los más sencillos de obtener.
Sometida a agitación mecánica la muestra se obtendrá una dispersión de las células.
(El medio debe ser aditivado para impedir la propagación de mohos y bacterias. Para ello se utiliza actidiona y un par de antibióticos: Un Gram + y un Gram -. También se pueden usar medios comerciales para este uso).

2. El siguiente paso será la extensión de la muestra en un medio sólido como puede ser agar-malta. Para ello se coloca una gota en la superficie de la placa Petri y se hace una extensión.

3. Una vez realizada la extensión se llevan a la estufa de cultivos para que crezcan las colonias.
Cada colonia que aparezca aislada en la superficie del medio, corresponderá a una única célula originaria y será por tanto una cepa pura.

4. A continuación se realiza la elección de las cepas a ensayar. Para ello nos valemos del aspecto de la colonia y de una revisión microscópica de las cepas que nos parezcan interesantes. No es conveniente elegir demasiadas colonias porque el trabajo de clasificación es largo aunque no complicado.

5. Una vez decididas las cepas que vamos a clasificar, lo cual se hará por la vitalidad/tamaño o por otros criterios, se preparan los medios para asimilación y los medios para fermentación. Es importante numerar las cepas con rotulador en el fondo de la placa para identificar con la cepa los tubos de los medios.
Suponiendo que estamos buscando cepas de Torulopsis sake necesitamos preparar 5 tubos de ensayo para medios de asimilación, 5 microfermentadores para medios de fermentación, 1 para asimilación de nitrato potásico, 1 para metabolización de etanol y 1 para la prueba de arbutina.

Para cada una de las cepas que vamos a estudiar, necesitamos un juego completo de tubos y fermentadores. (De ahí nuestra recomendación de no elegir demasiadas colonias).
Los sustratos puros se disuelven en agua y se esterilizan en autoclave.
Siempre hay que reservar un tubo y un fermentador sin sembrar (en blanco) para que quede garantizada la calidad de la esterilización.

6. Seguidamente se siembran picando con aguja de platino en la colonia elegida y haciendo una inmersión en los medios en cámara estéril o bien cerca de un mechero de Bunsen a llama fuerte.

7. Realizada la siembra, se pasa a la propagación en estufa de cultivo.

8. Pasados los 3 días de crecimiento se leen los resultados y se llevan a las claves para averiguar si la cepa estudiada corresponde al género y especie que buscamos.

9. Las cepas que consideremos válidas para el estudio se trasladarán a una cuña en tubo de ensayo para su conservación por tiempo indefinido utilizando el menor espacio posible.

Trabajos de laboratorio

Una vez que se han identificado las colonias, el siguiente trabajo depende de los objetivos que se persigan.

a) Supongamos que buscamos una cepa pura que tenga una mejor resistencia al frío que la cepa de referencia.
Entonces tendremos que someter a una fermentación de un sustrato estándar a la cepa investigada junto a la cepa patrón y medir el volumen de gas que ambas producen a la temperatura de ensayo.
Lógicamente tenemos que partir de inóculos iguales. Para conseguir esto hay que medir la cantidad de inóculo mediante bioluminiscencia o más sencillamente mediante cámara Thomas de conteo al microscopio.

b) Supongamos que lo que buscamos es una cepa que tenga mayor capacidad fermentativa que la cepa patrón. Entonces tendremos que preparar un medio complejo con más azúcares que los supuestamente fermentecibles y someter a una prueba de atenuación límite a ambas cepas.
El método operativo consiste en situar los dos fermentadores en un agitador común y tomar diariamente la densidad de ambas muestras y llevarlas a un gráfico. El descenso de la densidad se producirá hasta el momento en que la falta en el medio de sustancias asimilables, dé lugar a una autolisis de las células de levadura. Como consecuencia de esto la densidad comienza a aumentar. En ese momento se toma el mínimo de la curva y se comparan los poderes asimilativos de ambas cepas para el sustrato ensayado.

c) Si lo que buscamos es una cepa con mayor vitalidad, bastará con medir el porcentaje de células muertas al final de una fermentación al límite y comparar.
Para estudiar el porcentaje de células muertas se utiliza al microscopio una cámara de conteo y una tinción mediante azul de metileno tamponado. Las células con vitalidad elevada no se tiñen.

Redacción de un informe

Como ocurre en cualquier trabajo, es fundamental redactar un trabajo con los resultados obtenidos.
Es muy importante que en el informe se acompañen tanto los datos de campo como una pormenorizada descripción de los resultados.
Y naturalmente el informe tiene que contener un código de trazabilidad con la muestra en cuña que hemos conservado.

Publicación en revista especializada

Si consideramos que los resultados de nuestro trabajo pueden resultar interesantes para nuestros colegas, se puede hacer una publicación de nuestros resultados.
En este caso hay que considerar que si hacemos público nuestro trabajo, puede ocurrir que algún colega nos pida una copia de nuestra cepa para su colección. Lo correcto es atender a las solicitudes de los compañeros.
Si no pensamos repartir muestras de nuestra cepa debemos advertirlo en la publicación.

Hasta aquí hemos descrito los procedimientos básicos en el trabajo con levaduras.
A continuación nos referiremos a los procedimientos normales para objetivos industriales y más adelante a los de los objetivos gastronómicos, que también se dan en este campo.

Ensayos de reproducción controlada

Si el objetivo es industrial el siguiente paso a la obtención de una cepa mejorada es el de la reproducción controlada.
Dependiendo de la pureza con la que se necesite la levadura, se utilizan para la propagación en masa diferentes métodos con el Jan De Klerck o el Anton Petersen - Henius.
Un aficionado que desee propagar una levadura debería utilizar una instalación de laboratorio cerrada realizada en vidrio.

Selección y mejora

En los procesos industriales, los procedimientos de selección y mejora se realizan a nivel de laboratorio de investigación y han quedado descritos en los primeros  bloques de este trabajo.
Normalmente la selección y mejora industriales se hace para fabricar un nuevo producto, para optimizar el proceso, o para mejorar las cualidades organolépticas del producto final.

Adecuación sustrato, hongo

Las industrias con base a levaduras no solo tienen que cuidarse de tener la mejor cepa para la fabricación de su producto.
El producto industrial es un compendio de la parte de sustrato que la levadura no metaboliza, de los metabolitos de la levadura y en muchos casos de la levadura misma.
Es por tanto evidente que se tiene que realizar un trabajo importante para suministrar a la mejor levadura posible, el mejor medio de cultivo que produzca el producto final más adecuado al mercado.

Generalmente los medios de comunicación son prolijos en publicar las variedades de uva que producen los mejores vinos, las recetas que producen las mejores cervezas, las mezclas de leches que producen los mejores quesos, las frutas que producen los mejores aguardientes y las mezclas que producen los mejores licores.
Pero ni los sustratos por sí mismos son garantía de calidad ni las levaduras tampoco.
El trabajo callado e importante que los periodistas no publican, quizás por ser algo muy difícil de explicar por un profano, es el del técnico que tiene que adecuar el sustrato a la levadura y controlar la mejor fermentación.

Hay que tener un gran conocimiento de la fisiología de una levadura y su metabolismo para inocularla en el medio más adecuado para sus exigencias.
Pero al mismo tiempo, los medios no se fabrican sintéticamente sino que la mayor parte de las veces son productos naturales que tienen limitados parámetros que puedan ser cambiados.
Normalmente un sustrato natural es un compendio de glúcidos, lípidos, prótidos, ácidos superiores, esteres, aldehídos, sales minerales...
Por tanto es necesario conocer la proporción de cada uno de estos elementos que conviene a la levadura y tratar de obtenerlo naturalmente por ser más barato, o artificialmente, lo cual es más caro siempre.

La levadura por su parte intentará asimilar el sustrato de la manera que más convenga a la mejora y perpetuación de su especie.
Pero como normalmente esto no es lo mejor para el producto que hay que vender, es necesario favorecer unas vías metabólicas y bloquear otras.
Cada oficio tiene su maestría y son tantos los que atañen a los hongos microscópicos que no podemos extendernos en este punto.

Inducción del crecimiento

En determinados casos lo que interesa es la producción de masa de hongos por su valor industrial intrínseco. Es el caso de la producción de levadura para los panaderos, de estárter para inocular los embutidos y chacinas, de levadura liofilizada para envasar como medicamentos, de levadura en tortas para pequeñas fábricas de cerveza o vinos, etc.
En estos casos lo que interesa no es el sustrato modificado sino que conviene inducir un gran crecimiento de masa celular despreciando el sustrato resultante.
Se eligen medios de poco precio y se aditivan con oligoelementos baratos.

Obtención del producto final

Los procedimientos dependen de qué parte del cultivo se desea: Medio modificado o masa celular.
Normalmente hay que hacer una separación por decantación, filtración o centrifugación.
En uno u otro caso, el aficionado no tendrá problema con la parte del cultivo que desecha. Sin embargo la industria sí los tiene ya que ambas partes tienen una elevada contaminación, ya se mida como Carbón Orgánico Total (COT) o como Demanda Química de Oxígeno.

Si consideramos que un río aceptablemente limpio tiene una DQO de 10 o 15, y que un resto de levaduras o de cultivo residual puede tener una DQO de 100.000, podremos calibrar el interés que tiene la depuración de los efluentes.
Afortunadamente mediante un tratamiento combinado por digestión anaerobia seguida de aerobia en plantas depuradoras (EDAR) se pueden disminuir estos valores a 25 0 30 DQO.

Habíamos expresado que si el objetivo es gastronómico las operaciones siguientes serían:

Limpieza y conservación

Esta fase, en Micromicología, se puede asimilar a la anteriormente explicada como separación.

Elección y ensayo de la receta adecuada

Si el interés es en el medio modificado, como en la fabricación de vinos, cervezas, aguardientes, quesos, etc., se deberá tener idea del resultado que se busca para elegir la levadura adecuada al medio disponible.

Degustación

Igual que los aficionados a las setas comestibles, se puede disfrutar del resultado de la excursión, solamente que la labor es considerablemente más larga.
Además el valor gastronómico no está en el hongo sino en la transformación que el hongo produce en el medio de cultivo.

ASPECTOS INTERESANTE DE LA AFICIÓN A LA MICOLOGÍA MICROSCÓPICA

Como hemos descrito, la Micromicología es una afición que puede resultar divertida.
Se pueden realizar excursiones junto con los aficionados a las setas e incluso se pueden simultanear ambas aficiones.
Es fácil la recolección, el transporte y la conservación.
Se puede realizar una labor científica y publicar trabajos.

O sea, es en todo comparable a la afición a las setas.

POSIBLES LÍNEAS DE TRABAJO

Los aficionados no necesitan que se les ofrezcan temas sobre los que desarrollar su afición, pero para los principiantes podríamos aportar algunos temas interesantes.

- Se puede realizar un aislamiento y clasificación de las levaduras de un vino o cerveza que nos gusta:
Salvo en los casos en que el fabricante esteriliza el producto final vía filtración amicróbica o por pasteurización fuerte de contenido y continente, lo que es totalmente legal, o vía antifermento lo que es ilegal, siempre quedan en el fondo de una botella en reposo algunas levaduras vivas. Esto nos permite aislar la levadura que se ha utilizado, clasificarla y después incluso intentar reproducir el proceso de fabricación ya que la uva utilizada, si se trata de vino, siempre se publica en la contraetiqueta, no así la levadura.

- Se puede preparar un estárter de embutidos:
La calidad gustativa de un embutido no depende solamente de la calidad de la materia prima, sino que la flora microbiana aporta una gran parte del aroma y el gusto.
En ciertos puntos geográficos son endémicas floras microbianas que producen el proceso de manera natural, pero si aislamos los microorganismos de un embutido que consideremos de gran calidad, los identificamos y realizamos su propagación, al añadir este estárter a la mezcla de materia prima podremos obtener un sabor y aroma muy semejantes al producto natural.

- Se puede obtener la levadura de un queso.
La mayor parte de las levaduras que aromatizan un queso se encuentran en la superficie.
Si aislamos, clasificamos y propagamos en medio acuoso la flora de un queso interesante, podemos disponer de un medio para mejorar quesos neutros.

- Fabricación casera de pan: Muchas personas echan de menos el sabor y el aroma de los panes del pasado.
Se pueden ensayar fabricaciones caseras de pequeñas porciones de pan utilizando gran cantidad de levaduras diferentes: Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces exiguus, Torulaspora delbrueckii, etc.

EQUIPO NECESARIO

Vamos a relacionar el mínimo equipo necesario para trabajar en Micromicología

Autoclave

Autoclave de sobremesa. La presión de esterilización y la temperatura son fijas de 1.15 Kg/cm2 (122 ºC), por lo que una olla a presión puede ser un comienzo más económico.

Estufa
Microscopio
Granatario
Estufa de cultivo
Microscopio
Granatario
Centrífuga para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Placas Petri
Centrífuga para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Placas Petri
Pipetas
Matraces Erlenmeyer
Mechero Bunsen
Pipetas
Matraces Erlenmeyer
Mechero Bunsen
Gradillas
Cubre y porta
Gradillas
Cubre y porta
Cámara Thomas
Asa de platino
Asa de Digralsky
Cámara Thomas
Asa de platino
Asa de Digraslky

Además se necesitará algodón graso, medios de cultivo y pequeño material como varilla de vidrio, espátulas etc.

El coste del equipo inicial no es bajo, pero siempre se pueden encontrar materiales de segunda mano, ofertas y gangas.

CONCLUSIÓN

Hemos tratado de animar a futuros micólogos a aficionarse a una alternativa a la de la recolección de setas.

Hemos procurado demostrar que es una actividad divertida que puede realizarse perfectamente en el seno de cualquier Asociación Micológica.